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月旭Welchrom ProCot G-25 預(yù)裝柱的使用方法
月旭Welchrom ProCot G-25 預(yù)裝柱的使用方法
2022-06-23
G-25葡聚糖凝膠填料，采用分子篩原理根據(jù)分子大小的不同來分離目標(biāo)蛋白。具有分辨率高、易收集、耐酸堿耐高溫等特點(diǎn)，且具有良好的穩(wěn)定性，主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)脫鹽。
如下，以IgG蛋白純化的脫鹽為例細(xì)說月旭Welchrom? ProCot G-25（5mL）預(yù)裝柱的使用方法：
溶液配制
a.蛋白溶液1（含檸檬酸鈉鹽）：Protein G 4FF親和柱純化IgG蛋白洗脫液。
b.平衡液1（20mM PB，pH7.0）：取100mL 0.2M PB（A液：B液=31:69）加水稀釋至1000mL。
A液（0.2M磷酸二氫鈉水溶液）：稱取NaH2PO4?H2O 27.6g溶于超純水中，稀釋至1L抽濾保存。
B液（0.2M磷酸氫二鈉水溶液）：稱取Na2HPO4?7H2O 53.6g (或Na2HPO4?12H2O 71.6g或Na2HPO4?2H2O 35.6g ) 加蒸餾水溶解，加水至1L。
c.平衡液2（150mM NaCl，20mM PB，pH7.0）：稱取8.766g NaCl，溶解于20mM PB中，調(diào)pH至7.0，定容至1L過水相濾膜抽濾。
d.柱清洗液1（0.5M NaOH）：稱取20g NaOH加超純水溶解至1L。
e.柱清洗液2（10%乙腈）：量取100mL經(jīng)有機(jī)濾膜抽濾好的乙腈，加超純水定容至1L。
f.保存液（20%乙醇）：取200mL無水乙醇加超純水稀釋至1L。
實(shí)驗(yàn)步驟
a.平衡：20mM PB（pH7.0）平衡后再用超純水平衡至基線穩(wěn)定
b.上樣：取1mL樣品溶液，通過A1管路上樣，流速0.5mL/min，待到檢測器顯示UV值出峰時(shí)開始收集，收集到峰值下降，電導(dǎo)值急劇增加的節(jié)點(diǎn)為①號(hào)管，而后收集至出峰結(jié)束為②號(hào)管。
c.柱清洗：用0.5M NaOH進(jìn)行柱清洗。
d.脫鹽效果色譜檢測：收集脫鹽前后樣品進(jìn)行色譜檢測，評(píng)價(jià)脫鹽效果。
過柱純化
表1 月旭Welchrom? PreCot G-25F純化參數(shù)
SEC-300色譜檢測
表2 月旭 Xtimate? SEC-300色譜柱檢測參數(shù)
譜圖和數(shù)據(jù)
圖1 G-25收集方法分離純化譜圖
圖2 G-25收集方法①號(hào)管收集
圖3 G-25收集方法②號(hào)管收集
結(jié)果分析：①號(hào)管中的蛋白脫鹽率達(dá)到97%，②號(hào)管中大部分為雜質(zhì)鹽，僅有少部分目標(biāo)蛋白。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
月旭Welchrom? PreCot G-25F（5mL，00051-33012）更適的收集方法為：從UV值出峰時(shí)開始收集，將蛋白峰值下降且電導(dǎo)值急劇增加至20以下作為收集節(jié)點(diǎn)，可以達(dá)到良好的脫鹽效果。再生使用脫鹽效果穩(wěn)定，脫鹽率保持在95%以上，PreCot G-25F預(yù)裝柱的更大脫鹽量為1mL可溶鹽溶液。
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